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漂亮、均勻的細(xì)胞培養(yǎng)板是怎么鋪出來的?
  • 發(fā)布日期:2022-10-21      瀏覽次數(shù):518
    •   做貼壁細(xì)胞的實(shí)驗(yàn),經(jīng)常需要做細(xì)胞鋪板。這個(gè)實(shí)驗(yàn)看似簡單,其實(shí)也不是那么好做的。關(guān)鍵是要鋪得均勻鋪得平整,要是中間密周圍稀,或者周圍密中間禿頂,那就露怯啦。
        從經(jīng)濟(jì)和高效的角度來說,需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板。如在進(jìn)行藥物對待測細(xì)胞半抑制率(IC50)測試時(shí),通常使用96孔板,一方面可以設(shè)置濃度梯度;另外還可一次性測多個(gè)藥物,減少實(shí)驗(yàn)誤差。
        1、收集細(xì)胞要混勻
        消化后的細(xì)胞一定要充分混勻,要把聚在一起的細(xì)胞團(tuán)充分地吹打開,最好是單個(gè)的狀態(tài),但同時(shí)又不能損傷細(xì)胞,可以用玻璃吸管的移液器操作。離心也很有講究,一般用1000 rpm/min即可。離心力太大細(xì)胞容易抱團(tuán)!然后懸浮離心后的細(xì)胞團(tuán)時(shí),先不要把所有液體都加進(jìn)去!一般先加2mL液體,然后用1mL移液器輕輕將細(xì)胞吹起,細(xì)胞要像云霧一樣散開,這樣易于形成單細(xì)胞。
        2、接種細(xì)胞須小心
        鋪6孔板,12孔板或24孔板,先在每個(gè)孔里面加1mL的培養(yǎng)基,晃動使之鋪勻整個(gè)孔底,然后加入1 mL的細(xì)胞懸液。從孔的左邊靠近底部慢慢加入,這樣細(xì)胞懸液會平鋪在整個(gè)孔底,細(xì)胞分散較均勻,注意加完細(xì)胞懸液后要放工作臺靜置一下。這里又有一個(gè)竅門,放在顯微鏡的載物臺上面。因?yàn)轱@微鏡的載物臺是水平校正過的,比什么桌面、超凈臺什么的要平多了。在載物臺上放置20-30分鐘,細(xì)胞不差這一會溫度和二氧化碳的,等細(xì)胞貼壁了,輕輕移入到孵箱中。
        鋪96孔板,我每孔是加100微升細(xì)胞懸液,加完半邊板48孔后,將剩下的未加的細(xì)胞懸液再混一下,再繼續(xù)加剩余的半邊板子,都加完后蓋上蓋子,左手輕輕扶住板的左邊,右手輕輕敲擊板的右邊緣,注意把握力度,敲三次即可,太大力或次數(shù)太多會導(dǎo)致細(xì)胞集中成堆。也有人推薦輕微的左三圈、右三圈、前三圈、后三圈。
        3、輕輕敲打勿抱團(tuán)
        細(xì)胞懸液加完后,將細(xì)胞培養(yǎng)板抬高,對著燈光,從底部往上看,看細(xì)胞有沒有抱團(tuán)。如果有抱團(tuán)的話,用手指從底部輕輕敲打,使之分散。也可以用平板振蕩器稍稍振蕩一下,效果不錯(cuò)。參數(shù)要設(shè)置成振幅小而頻率高哈。
        4、十字交叉要水平
        觀察和敲打后放入培養(yǎng)箱,然后畫“十字”,就是把細(xì)胞培養(yǎng)板貼著培養(yǎng)箱擱板,前后方向來回晃動10次,再左右方向晃動10次,正好是一個(gè)“十” 字形。然后就讓它靜靜地呆在培養(yǎng)箱擱板上,沒事不要去動它。這里要注意的是,托架應(yīng)該裝在四根立柱相同高度的孔上,培養(yǎng)箱的擱板要水平校正,盡量地做到水平。擱板會向一個(gè)方向傾斜,對于貼壁時(shí)間長的細(xì)胞,就算當(dāng)時(shí)混勻了,放進(jìn)培養(yǎng)箱后也搖勻了,但是重力作用下細(xì)胞也會向一側(cè)聚集。 培養(yǎng)箱里面或者外面盡量不要放可以產(chǎn)生振動的儀器,比如蠕動泵、離心機(jī)、渦旋器一類的儀器。這些儀器產(chǎn)生的振動對細(xì)胞貼壁有影響,也可能會導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不均勻。還是要給細(xì)胞一個(gè)安安靜靜的生長環(huán)境,讓他安靜地做個(gè)美男子好了。
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