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細(xì)胞分離技術(shù)
  • 發(fā)布日期:2017-12-19      瀏覽次數(shù):1850
    • 1.  從原代組織中分離細(xì)胞 將組織塊分離(散)成細(xì)胞懸液的方法有多種,zui常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。

       

      從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短,以保持zui大的活性。下列步驟可以解聚整個(gè)組織,獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞。

       

      (1)胰蛋白酶 (Trypsin)

      ●在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

      ●將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶)。

      ●在4℃孵育6到18小時(shí),使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

      ●移棄組織碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

      ●在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基,要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

      ●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)(100~200 mm)過濾,分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)。

       

      (2)膠原酶 (Collagenase)

      ●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

      ●加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。

      ●在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

      ●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。

      ●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

      ●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)。

       

      (3)Dispase

      ●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

      ●加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液)

      ●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

      ●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。

      ●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

      ●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)。

       

      2.  從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞,且保持細(xì)胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用,每一種系統(tǒng)*條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)加以確定。

       

      ●再次培養(yǎng)時(shí)檢測細(xì)胞的活性。

      ●細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%

      ●對于無血清培養(yǎng)基,降低胰蛋白酶使用量。

       

      (1) 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

      (2)使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗細(xì)胞(看表確定正確的清洗溶液)。在培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面加入清洗溶液,通過轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層,然后去除清洗液。

      (3) 以2~3 ml/25 cm2的量,加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面。確保分離液覆蓋細(xì)胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶,輕輕搖動培養(yǎng)瓶。通常,在5到15分鐘內(nèi),細(xì)胞就會脫落。細(xì)胞分離需要的時(shí)間因細(xì)胞系不同而有所變化。仔細(xì)監(jiān)測細(xì)胞分離過程,避免細(xì)胞受損傷。對難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系,可以輕輕敲打,以加速分離過程。

      (4)當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí),垂直放置培養(yǎng)瓶,讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基,通過移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來分散細(xì)胞。計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

      (5)對于無血清培養(yǎng)基,加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。

    魏經(jīng)理
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